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ATP检测方法

发布日期:2022-12-27 00:00 来源:http://www.chuqi.net 点击:

ATP检测方法
三磷酸腺苷(Adenosine Tri-Phosphate, ATP)是自然界各种生命活动中共用的能量载体。无论是真核细胞还是原核细胞,都以ATP作为能量储存和转移的分子。ATP可作为细胞活性的一个标志物。具有代谢活性的细胞含有一定量的ATP,检测ATP含量可作为培养细胞增殖和细胞毒性的定量指标;而在细胞发生凋亡或坏死时,其ATP含量会迅速下降。通过监测ATP含量的改变,可以评价多种药物、生物制剂或生物活性物质引起的细胞杀伤、细胞抑制和细胞增殖作用。ATP也常作为微生物污染的一个指标,微生物繁殖引起食品、药品等ATP含量的增高,可以被敏感地检测到。

ATP检测可以用成色反应、荧光、化学发光或同位素等方法实现。采用化学发光方法检测ATP,具有更高的敏感性,并具有简便、快速等特点,因此是目前更为流行的方法。化学发光方法检测ATP,是基于萤火虫荧光素酶催化荧光素氧化,消耗ATP,发出光子的高效发光反应;该反应的发光效率极高,发光量与ATP含量有很好的线性关系。本公司生产的ATP检测试剂盒,应用突变重组的萤火虫荧光素酶,催化长时发光反应,专门测定ATP含量。

生物体内多种酶促反应以ATP为底物,消耗能量;ATP的高能磷酸键断裂,形成ADP或AMP。多种具有重要生物功能的酶如激酶、ATP酶等产生ADP,通过检测其酶促反应中ADP与ATP比值,可以间接监测酶促反应的进程。细胞在发生凋亡或坏死时,其ADP与ATP含量的变化特征不同,检测细胞中ADP与ATP比值,也是区分细胞凋亡或坏死的一个间接指标。本公司生产的ATP/ADP检测试剂盒,在测定ATP含量的基础上,进一步将ADP转化为ATP,采用相同的ATP测定方法,对ADP含量进行定量,从而得到ADP与ATP比值。单个样品一体化的测定方法,给实验工作带来很大的便利。
1. 电泳法:根据核苷酸分子同时携带酸碱基团,在一定条件下,利用其在电场中的迁移速度不同而实现分离。

1) 纸电泳法: 将电场加在浸泡过缓冲液的滤纸上,使ATP与其他杂质分离,再利用比色法测定ATP的吸收值,计算其含量。此法是卫生部及地方采用的ATP标准检测方法。

2) 凝胶电泳法:根据介质不同,可分为聚丙烯酰胺电泳法(PAGE),SDS-PAGE和琼脂糖凝胶电泳法,前两种方法常用于生物机制的研究。琼脂糖凝胶电泳法是以琼脂糖为介质,柠檬酸为缓冲液,利用电泳将ATP与杂质分离,实现ATP含量检测。

3) 毛细管电泳法:以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,利用各组分间淌度和分配行为上的差异,实现ATP与杂质的分离。

2. 光学分析法:因其操作简单、仪器要求低,常用于科研领域的ATP含量分析。

1) 分光光度法:采用ATP试剂盒,因ATP腺嘌呤碱基上存在共轭双键,在紫外下有吸收峰,可用紫外分光光度法检测ATP含量。

2) 生物发光法:利用荧光素在荧光素酶的作用下,与ATP发生反应,生成荧光素-ATP复合体,该复合体被分子氧氧化后激发荧光素发光,根据发光强弱可检测ATP含量。

3. 层析法:利用样品各组分之间亲和力、分配系数等化学性质的差异,实现ATP与其它杂质的分离。

1) 纸层析法:是检测核苷酸含量的常用方法之一。该方法常以异丙醇、浓氨水和水按7:1:2的混合作为展开剂。

2) 薄层层析法:该方法纸层析法原理基本相同,也是检测核苷酸含量的常用方法之一,其常用的展开剂是正丁醇、丙酮、冰乙酸、氨水、水按7:5:3:3:2的比例混合而成。

3) 离子交换色谱法:利用样品各组分离子交换能力或选择系数之间的差异,实现分离,常用于工业生产中ATP含量检测。

4) 高效液相色谱法:此方法具有强大的分离能力,操作简单,分析时间短,灵敏度高,结果准确,是目前应用广泛的一种ATP检测方法

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